引言

在細(xì)胞和組織培養(yǎng)領(lǐng)域，從上世紀(jì)70年代起2維（2D）培養(yǎng)的局限性和3維（3D）培養(yǎng)的優(yōu)點引來諸多關(guān)注，越來越多的研究希望將細(xì)胞從平面環(huán)境中轉(zhuǎn)變到3D空間來。當(dāng)前，雖然對基于細(xì)胞的效應(yīng)研究和毒性測試中，制藥工業(yè)如今zui常用的依舊是2D方式，3D培養(yǎng)技術(shù)已在學(xué)術(shù)研究中被廣泛應(yīng)用。隨著在生物相關(guān)性，通量，產(chǎn)出量等方面的改進(jìn)，伴隨3D培養(yǎng)成本的降低，3D培養(yǎng)在再生醫(yī)學(xué)，基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)中的應(yīng)用將越來越廣泛，一場細(xì)胞由2D培養(yǎng)走向3D的變革正在發(fā)生。

2D細(xì)胞培養(yǎng)的局限性與3D培養(yǎng)的優(yōu)勢

細(xì)胞增殖，分化和代謝等生理活動都嚴(yán)重受到微環(huán)境的影響。當(dāng)前細(xì)胞生物學(xué)研究大多還是在二維平面培養(yǎng)進(jìn)行，這種平面培養(yǎng)、生長方式與機(jī)體內(nèi)立體環(huán)境差別很大，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)、分化、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用以及細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用與體內(nèi)生理條件下細(xì)胞的行為存在明顯差異。2D和3D環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞相比較，諸多生理指標(biāo)都顯著不同，例如原代小鼠乳腺管腔上皮細(xì)胞(mammary luminal epithelial cells, MEC)在3D基底膜基質(zhì)中增殖的時間明顯長于2D培養(yǎng)環(huán)境；更有甚者，有時藥物作用于2D培養(yǎng)的細(xì)胞呈現(xiàn)的效應(yīng)與3D細(xì)胞相反。3D培養(yǎng)可以設(shè)計模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，讓細(xì)胞在生理行為上與機(jī)體實際的生理環(huán)境更接近。正因為此，很多藥物研發(fā)企業(yè)和護(hù)膚品生產(chǎn)企業(yè)更傾向于使用3D培養(yǎng)細(xì)胞（或組織類似物）來開展實驗、研究：3D培養(yǎng)讓藥物研發(fā)企業(yè)相當(dāng)程度上擺脫了倫理3R對動物實驗的約束，縮短了研發(fā)周期，提高了結(jié)果可信度，研發(fā)少走了彎路，從而節(jié)省了成本，提高了企業(yè)的競爭力?？梢灶A(yù)見，未來在高通量，自動化，低成本，廣應(yīng)用性和高預(yù)測性等方面3D培養(yǎng)將逐步突破并日趨成熟、完善，2D培養(yǎng)向3D的轉(zhuǎn)變成為必然的發(fā)展趨勢和時代潮流。

3D細(xì)胞培養(yǎng)的主要類型

當(dāng)前市場上有多種類型的3D培養(yǎng)系統(tǒng)，根據(jù)產(chǎn)品是否為細(xì)胞提供支撐（支架）材料（scaffold）大體可分為兩種類型：基于scaffold的培養(yǎng)體系和無scaffold的培養(yǎng)體系。Scaffold則又有天然成分和人工合成成分之分。

一、無scaffold的培養(yǎng)體系

沒有供細(xì)胞粘附、生長和擴(kuò)散的支撐結(jié)構(gòu)，使培養(yǎng)基中的細(xì)胞聚集成為類似于組織的微組織球體（microtissue spheroids）。無scaffold的培養(yǎng)體系可通過懸滴（hanging drops）讓細(xì)胞在重力的作用下通過自組裝形成微球體。這種方法的優(yōu)點是可以通過控制懸滴而的控制微組織球，使其具有高一致性，為后續(xù)研究提供好的微組織材料。而且通過懸滴法可以實現(xiàn)對不同細(xì)胞類型的共培養(yǎng)，保證共培養(yǎng)細(xì)胞間的信息交流。

無scaffold的培養(yǎng)懸滴培養(yǎng)體系的代表性廠家為InSphero，他們的96孔板設(shè)計可以通過手動操作，也支持自動化上樣裝置輕松實現(xiàn)微組織培養(yǎng)，在腫瘤研究和新型抗癌藥物篩選等領(lǐng)域中被廣泛選用。

下面對InSphero的懸滴培養(yǎng)技術(shù)做一簡要介紹：

InSphero技術(shù)生產(chǎn)的GravityPLUS™板使懸滴細(xì)胞培養(yǎng)變得異常簡單。只需用液體處理裝置(liquid handling device)—手動吸管或自動化96孔上樣機(jī)器手，在上端添加50μL細(xì)胞懸液即可。長時間培養(yǎng)或是分化研究時，可以移走多達(dá)70%的舊培基，然后在上端加入新培基。微組織形成后就可以使用一次簡單的培基添加步驟將微組織收入GravityTRAP™板中。GravityTRAP™板專有的非粘附包被技術(shù)可使微組織在無依附、不解聚情況下培養(yǎng)數(shù)星期。另外，其*的設(shè)計能保證在不擾動微組織情況下實現(xiàn)培基更換、并可直接通過培養(yǎng)孔板下方實現(xiàn)成像分析（例如高內(nèi)涵分析, high-content analysis）。

更多關(guān)于InSphero產(chǎn)品的介紹請參考如下鏈接：

http://www.mmcare.cn/qxky001-Products-18502066/

http://blog.sina.com.cn/s/blog_7038ff370101m2vs.html

http://blog.sina.com.cn/s/blog_7038ff370101m2vv.html

其它無scaffold產(chǎn)品還有：3D Biomatrix公司的Perfecta3D懸滴板通過懸滴技術(shù)實現(xiàn)微組織培養(yǎng)。Nano3D Biosciences公司的Bio-Assembler采用磁懸浮技術(shù)，通過將細(xì)胞磁化，使其在磁場中懸浮實現(xiàn)3D培養(yǎng)。InfiniteBio公司SCIVAX 3D產(chǎn)品，其NanoCulture Plate (NCP)為合成聚合物(synthetic polymer)材料，具有超低粘附力的微板結(jié)構(gòu)表面，細(xì)胞在此微結(jié)構(gòu)上遷徙、相互粘附形成微球體。BioLevitator應(yīng)用磁性微球載體，整合3D和微載體培養(yǎng)技術(shù)實現(xiàn)高密度3D細(xì)胞培養(yǎng)；microtissues的3D petri Dish通過瓊脂界面進(jìn)行3D培養(yǎng)等。

二、基于scaffold的培養(yǎng)體系

1. 根據(jù)支持物的性質(zhì)分類，基于scaffold的培養(yǎng)體系可分為天然細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）作為支持材料的3D培養(yǎng)和人造基質(zhì)作為支持材料的3D培養(yǎng)。

（1）天然ECM作為支持材料的3D培養(yǎng)

這種方法以天然ECM作為支持材料，根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞類型，優(yōu)化3D培養(yǎng)基質(zhì)配方，以滿足不同組織細(xì)胞的培養(yǎng)需求。很多公司都可提供細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)品用于3D培養(yǎng)，例如TAP Biosystems（已被Sartorius Stedim Biotech收購）的RAFT膠原系統(tǒng)，Matrigel模擬基底膜基質(zhì)產(chǎn)品；Advanced BioMatrix，Amsbio和Sigma-Aldrich公司也都有細(xì)胞外基質(zhì)凝膠產(chǎn)品。但天然基質(zhì)材料存在一定病原風(fēng)險，且材料可能存在批次差別性等缺點。

（2）人造基質(zhì)作為支持材料的3D培養(yǎng)方法

合成的人造基質(zhì)材料類型相當(dāng)多，例如Cellendes的3D Life仿生水凝膠材料；3D Biotek公司有多種3D大分子支架材料；Reinnervate公司Alvetex產(chǎn)品用的是聚苯乙烯(polystyrene scaffold)；Life Tech公司的AlgiMatrix 3D培養(yǎng)系統(tǒng)采用褐藻原料；Synthecon和Xanofi的納米纖維技術(shù)平臺XanoMatrix采用合成納米生物基質(zhì)和培養(yǎng)材料；PuraMatrix采用合成肽水凝膠；其它合成材料產(chǎn)品還包括Lena Biosciences的SeedEZ等。

Cellendes的3D Life仿生水凝膠材料可以說是合成的人造基質(zhì)材料的代表。Cellendes的3D Life仿生水凝膠通過合成大分子材料和交聯(lián)劑(crosslinker)方式和比例的靈活組合，構(gòu)建不同的3D細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。這種高化學(xué)和機(jī)械柔性（flexibility）的合成系統(tǒng)賦予了該材料較動物源性支持材料更多的優(yōu)勢。諸多優(yōu)點使3D Life仿生水凝膠不但是普通3D培養(yǎng)的上佳選項，也使其成為細(xì)胞擴(kuò)散和遷移研究的理想產(chǎn)品。

下文對Cellendes的3D Life Biomimetic Hydrogel System做一簡單介紹：

3D life仿生水凝膠系統(tǒng)與活體細(xì)胞外基質(zhì)類似，可使體外細(xì)胞培養(yǎng)更接近體內(nèi)的生理特征，是基礎(chǔ)研究、藥物篩選和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的理想選擇。這類產(chǎn)品的優(yōu)點主要體現(xiàn)在如下三個方面：A)產(chǎn)品組合靈活。B)操作簡單，控制自如。C)應(yīng)用范圍廣泛：可用于細(xì)胞培養(yǎng)、標(biāo)記和顯微觀察等諸多方面；細(xì)胞可在凝膠內(nèi)也可在凝膠表面培養(yǎng)；可活細(xì)胞直接觀察也可選擇原位固定后觀察；支持GFP等多種報告基因標(biāo)記后觀察方式；可選擇不同類型細(xì)胞共培養(yǎng)，更好模擬體內(nèi)生理狀態(tài)。

3D life主要有兩種水凝膠：PEG-Link交聯(lián)形成的水凝膠和CD-Link交聯(lián)形成的水凝膠：

細(xì)胞在PEG-Link交聯(lián)形成的水凝膠中培養(yǎng)

細(xì)胞可以通過單細(xì)胞或是細(xì)胞團(tuán)的形式埋在PEG-Link為交聯(lián)劑的水凝膠中，根據(jù)細(xì)胞類型不同，形成上皮樣囊結(jié)構(gòu)，微球體或是克隆?？梢愿鶕?jù)需要考慮為生成特定的表型而添加相應(yīng)的細(xì)胞粘附因子。細(xì)胞不能在這種水凝膠中遷移擴(kuò)散。

細(xì)胞在CD-Link交聯(lián)形成的水凝膠中培養(yǎng)

細(xì)胞可以通過單細(xì)胞或是細(xì)胞團(tuán)的形式埋在CD-Link為交聯(lián)劑的水凝膠中，培養(yǎng)的細(xì)胞如產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶則能將臨近的基質(zhì)交聯(lián)劑切割。在添加相應(yīng)粘附因子基序下，細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞擴(kuò)散和遷移。

3D life水凝膠中細(xì)胞的固定與標(biāo)記

使用小分子物質(zhì)，例如熒光標(biāo)記phalloidin，核酸染料，活性和毒性檢測試劑，增值檢測試劑等小分子物質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記方法，除了在孵育時間上適度延長以便能在水凝膠中充分?jǐn)U散外，與傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)方式相同。所培養(yǎng)的細(xì)胞如果經(jīng)基因修飾還有熒光蛋白，則可直接用于觀測，因凝膠*透明不影響觀測結(jié)果。如果使用抗體等大分子對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記則不能直接在水凝膠中開展，因水凝膠的孔徑原因，不適合直接抗體標(biāo)記，需要使用dextranase將細(xì)胞從水凝膠中釋放出來，如果擔(dān)心細(xì)胞在操作過程中細(xì)胞生理活動波動，則可經(jīng)在凝膠中將細(xì)胞固定后在進(jìn)行操作。

更多關(guān)于Cellendes產(chǎn)品的介紹可參考如下鏈接：

http://www.mmcare.cn/qxky001-Products-18500597/

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2. 如果按支持材料形成的方式分，基于scaffold的培養(yǎng)體系可分為如下兩類，一種是將細(xì)胞分散在液體水凝膠中，然后通過交聯(lián)實現(xiàn)3D培養(yǎng)，這類產(chǎn)品代表生產(chǎn)商包括Cellendes, Matrigel, Glycosan Biosystems和QGel等；另外一種是將細(xì)胞“播種"在3D基質(zhì)上，這類方法的代表廠商包括3D Biotek, Alvetex和AlgiMatrix等。*種方式中的Cellendes產(chǎn)品上面已經(jīng)做了簡要介紹；下面將細(xì)胞“播種"在3D基質(zhì)方法的代表產(chǎn)品3D Biotek給予簡要介紹：

3D Biotek得益于其精妙的3D微細(xì)加工技術(shù)和先進(jìn)的生物制造工藝，產(chǎn)品在干細(xì)胞/組織工程、藥物研發(fā)和細(xì)胞生物應(yīng)用等涉及3D培養(yǎng)的領(lǐng)域處于地位。

根據(jù)用戶的不同需求，3D Biotek提供系列的產(chǎn)品和裝置，包括多種3D細(xì)胞培養(yǎng)的支架材料：例如可生物降解的聚已內(nèi)酯3D Insert PCL，這種材料已經(jīng)被美國標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)協(xié)會(NIST)認(rèn)定為標(biāo)準(zhǔn)的3D組織培養(yǎng)支架材料；聚苯乙烯3D Insert PS材料。

3D Biotek開發(fā)有*的可直接用于如細(xì)胞凋亡和熒光ELISA等熒光和化學(xué)發(fā)光實驗的新材料培養(yǎng)板。

3D Biotek還提供可降解生物材料Poly(DL-lactide-co-glycolide) (PDLLGA)。

3D Biotek有用于3D腫瘤細(xì)胞或干細(xì)胞培養(yǎng)(或共培養(yǎng))的仿生基底膜：3D Insert-PS/PCL (聚苯乙烯/聚已內(nèi)酯)納米篩網(wǎng)。

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入3D培養(yǎng)的細(xì)胞的3D轉(zhuǎn)染試劑盒(BioCellChallenge, SAS)。

多種3D Biotek技術(shù)制造多孔聚合物支架材料填充的3D生物發(fā)生器（3D Bioreactor），即包括可生物降解聚合物(polystyrene, PS)也包括不能生物降解聚合物(polycaprolactone, PCL)類型。

各種預(yù)填充了孔狀3D Insert™支架材料的塑料裝置，如3D Insert™ PS (聚苯乙烯)支架，3D Insert™ PCL (聚已內(nèi)酯)支架，3DKUBE™等。

用于骨組織工程中常用的可*吸收的生物陶瓷材料B-TCP盤(Disc)，用于骨質(zhì)疏松癥，骨基質(zhì)礦化，組織鈣化和骨修復(fù)等各種骨相關(guān)研究的HA盤(Disc)等。

選用3D Biotek產(chǎn)品能獲得高的細(xì)胞培養(yǎng)效率；增加細(xì)胞因子、抗體和其它生物分子的產(chǎn)出量，且生成的細(xì)胞因子、抗體等易于分離；減少動物實驗，體外研究即可獲高預(yù)測性資料，在開發(fā)新藥中降低成本和時間，縮短進(jìn)入市場的時間等優(yōu)點。

更多關(guān)于3D Biotek產(chǎn)品的介紹可參考如下鏈接：

http://www.mmcare.cn/qxky001-SonList-1090610/

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三、微流體技術(shù)與3D培養(yǎng)

當(dāng)前很多研究致力于將微工程學(xué)和微流體學(xué)與3D培養(yǎng)結(jié)合，開發(fā)灌流3D培養(yǎng)系統(tǒng)（perfused 3D culture systems）。動態(tài)灌流培養(yǎng)比靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)更具優(yōu)勢，細(xì)胞能充分接觸到營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣。這類產(chǎn)品包括Provitro GmbH的灌流培養(yǎng)體系(Perfusion culture sys. PCS)，3D Biotek公司的3D Perfusion系統(tǒng)，Synthecon公司的旋轉(zhuǎn)3D培養(yǎng)系統(tǒng)RCCS生物反應(yīng)器，Zellwerk的Z RP (Red Point)培育平臺；Gradientech的CellDirector產(chǎn)品則將細(xì)胞趨化與3D環(huán)境相結(jié)合起來。

下面選擇Provitro GmbH灌流培養(yǎng)體系做簡單介紹：

細(xì)胞單層培養(yǎng)技術(shù)zui大限度降低了組織復(fù)雜性。但其缺點是缺少了細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞代謝和細(xì)胞表達(dá)呈現(xiàn)去分化狀態(tài)。與單層細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)比較，3D培養(yǎng)下細(xì)胞可通過細(xì)胞外基質(zhì)擴(kuò)展，達(dá)到高濃度和營養(yǎng)供應(yīng)狀態(tài)。Provitro GmbH的3D培養(yǎng)通過自動化的灌流培養(yǎng)體系來滿足3D培養(yǎng)所需要的更嚴(yán)格的細(xì)胞培養(yǎng)條件，在該體系下培養(yǎng)可保證穩(wěn)定的營養(yǎng)濃度供應(yīng)，穩(wěn)定的pH值，并降低污染風(fēng)險。

a)灌流培養(yǎng)體系：Provitro提供的灌流培養(yǎng)體系用顯微鏡可隨時觀察細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)，可保證整個灌流體系內(nèi)細(xì)胞營養(yǎng)充足，沒有培養(yǎng)死角；b)管狀細(xì)胞灌流培養(yǎng)體系(Tube chamber system TCS)；c)流動灌流培養(yǎng)體系(Flow chamber system FCS)；d)灌流環(huán)路(Perfusion circuit)，包括灌流環(huán)路PCS3c (Perfusion circuit PCS3c)，灌流環(huán)路TCS2c (Perfusion circuit TCS2c)，灌流環(huán)路TCS1c (Perfusion circuit FCS1c)；e)根據(jù)用戶的特殊需求定制的灌流培養(yǎng)體系(Customisation)

Provitro GmbH主要關(guān)注組織培養(yǎng)和灌流研究，更多產(chǎn)品信息可參考如下鏈接：

http://blog.sina.com.cn/s/blog_7038ff370101lyxz.html

3D培養(yǎng)的缺點與局限

3D培養(yǎng)對藥物研發(fā)和毒性測試意義重大，但當(dāng)期也有一些問題尚待解決。包括：當(dāng)前多數(shù)系統(tǒng)還不能模擬體內(nèi)的生物機(jī)械動態(tài)特性；動物源或人源的支撐材料有一定病原風(fēng)險，且這類材料可能存在批次差別性，在重復(fù)性上不及合成的支架材料。Scaffold培養(yǎng)方法在RNA、蛋白提取時需要注意，當(dāng)然，當(dāng)前已經(jīng)開發(fā)了酶或是其它試劑在不損傷細(xì)胞條件下消化去除這類scaffold，另外，一些生化測定、圖像掃描和熒光檢測方面，scaffold是否存在影響，在選擇產(chǎn)品時需要考慮到?？傮w上說，材料科學(xué)與生物學(xué)的結(jié)合使當(dāng)前3D培養(yǎng)方式越來越多樣化，用戶的選擇空間很大，可在比較中找到自己的方法。眾多的3D培養(yǎng)方法重點關(guān)注如何讓3D體系更加接近人體實際環(huán)境，而對藥物研發(fā)企業(yè)，他們除了模擬實際環(huán)境，還要求、自動化和可承受的使用成本。當(dāng)前3D分析尚須實現(xiàn)飛躍，從而實現(xiàn)3D培養(yǎng)體系工業(yè)化應(yīng)用便捷和高read-out。